Nowa metoda analityczna latanoprostu w kroplach do oczu

Czym jest jaskra i jak działa latanoprost?

Jaskra to grupa przewlekłych chorób oczu charakteryzujących się postępującą degeneracją nerwu wzrokowego i warstwy włókien nerwowych siatkówki (RNFL), prowadzącą do nieodwracalnej utraty wzroku, jeśli nie jest leczona. Jest to choroba cywilizacyjna i druga najczęstsza przyczyna ślepoty po zaćmie. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) na jaskrę cierpi na całym świecie 64 miliony osób, a liczba ta ma wzrosnąć do 111,8 miliona w 2040 roku. Leczenie jaskry obejmuje miejscowe leki, terapię laserową i zabieg chirurgiczny. Leczenie farmakologiczne oferuje szeroką grupę leków przeciwjaskrowych, w tym analogi prostaglandyn (bimatoprost, latanoprost, trawoprost i tafluprost), antagonisty receptorów beta-adrenergicznych (timolol, lewobunolol, metipranolol, karteolol, befunolol i betaksolol), agonisty receptorów alfa-2 adrenergicznych (apraklonidyna, brymonidyna i klonidyna), inhibitory anhydrazy węglanowej (brynzolamid i dorzolamid), nieselektywne agonisty adrenergiczne (epinefryna i dipiwefryna), parasympatykomimetyki (pilokarpina i karbachol), leki osmotyczne (glicerol, izosorbid i mannitol) oraz nowej generacji inhibitory rho-kinazy (ripasudil i netarsudil). Spośród nich lekami pierwszego wyboru w jaskrze otwartego kąta i podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym są syntetyczne analogi prostaglandyny F2α, ze względu na ich wysoką skuteczność, schemat podawania raz dziennie i dobry profil bezpieczeństwa. W wyniku terapii analogami prostaglandyn można osiągnąć redukcję IOP o około 30%, podobną do wyników uzyskiwanych przy zastosowaniu najnowocześniejszej terapii, tj. selektywnej trabekuloplastyki laserowej (LST), która jest uważana za wysoce skuteczne leczenie.

Latanoprost jest nieaktywnym prolekiem w postaci estru izopropylowego kwasu latanoprostowego. Jest hydrolizowany do aktywnej cząsteczki kwasu latanoprostowego podczas penetracji rogówki poprzez działanie hydrolazy w ludzkiej rogówce. Chemicznie charakteryzuje się jako izopropyl (Z)-7-[(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihydroksy-2-[(3R)-3-hydroksy-5-fenylopentylo]cyklopentylo]-5-heptenonian. Literatura donosi, że technika HPLC z detekcją UV jest powszechnie stosowana i odpowiednia do oznaczania analogów prostaglandyn zarówno w czystych substancjach, jak i w preparatach farmaceutycznych. Oficjalne monografie latanoprostu istnieją w USP-NF i Ph. Eur., dlatego dostępne są oficjalne metody HPLC z detekcją UV do jednoczesnego oznaczania zawartości, a także dziesięciu zidentyfikowanych organicznych zanieczyszczeń procesowych latanoprostu w API. Te metody wykorzystują chromatografię w fazie normalnej ze względu na wysoce lipofilny charakter latanoprostu, co jest niemożliwe do zastosowania w wodnych preparatach okulistycznych. Obie monografie API opisują oddzielną metodę ilościowego oznaczania pokrewnej substancji, kwasu latanoprostowego, za pomocą RP-HPLC.

Według naszej najlepszej wiedzy, żadna z dostępnych metod nie jest przeznaczona do jednoczesnego oznaczania ilościowego latanoprostu i znanych zanieczyszczeń latanoprostu (D (propan-2-yl 5-(difenylofosforyl)pentanoat), H (kwas latanoprostowy), F (5,6-trans latanoprost), E (15-S latanoprost), enancjomer latanoprostu, 15-ketolatanoprost, TPPO (tlenek trifenylofosfiny) i niezidentyfikowane produkty degradacji) w prostych lub złożonych preparatach farmaceutycznych, z lub bez konserwantu BAC. Dlatego, zgodnie z zaleceniami ICH, celem tego badania było opracowanie i walidacja nowej chromatograficznej metody odwróconej fazy wskazującej na stabilność, specyficznej dla latanoprostu i sześciu substancji pokrewnych w kroplach do oczu zawierających latanoprost, a także latanoprost w połączeniu z timololem w preparatach testowanych w obecności chlorku benzalkoniowego.

Jak opracować precyzyjną metodę analityczną dla latanoprostu?

Głównym założeniem przyjętym w planie opracowania metody było określenie wymagań, które jednocześnie określają zawartość i wybrane znane zanieczyszczenia. Za krytyczne uznano następujące parametry rozdzielczości metody (Rs ≥ 1,0) między sygnałami wynikającymi z zanieczyszczeń i API – współczynnikami symetrii (As) piku latanoprostu w zakresie 0,8-2,0 oraz granicą oznaczalności LOQ ≥ 0,1%. W przemyśle farmaceutycznym strategie kontroli produktów leczniczych wymagają monitorowania zanieczyszczeń pochodzących z degradacji substancji czynnych powyżej określonego progu raportowania wynikającego z maksymalnej dawki dobowej stosowanego produktu. W przypadku kropli do oczu zawierających latanoprost w stężeniu 0,005%, maksymalna ilość latanoprostu podawanego pacjentowi na dobę wynosi 3 µg (1 kropla (30 µL) do każdego oka na dobę). Zgodnie z wytycznymi ICH Topic Q 3 B (R2) dotyczącymi zanieczyszczeń w nowych produktach leczniczych, próg raportowania dla produktów o maksymalnej dawce dobowej ≤ 1 g wynosi 0,1%. Dlatego wszystkie zanieczyszczenia latanoprostu zidentyfikowane i niezidentyfikowane w produkcie na poziomie 0,1% muszą być ilościowo oznaczone. Metoda analityczna musi być wystarczająco czuła, aby zapewnić oznaczenie zanieczyszczeń z odpowiednią precyzją na wskazanym poziomie raportowania. Metoda stosowana do oznaczania substancji pokrewnych latanoprostu musi wykazywać granicę oznaczalności (LOQ) nie większą niż próg raportowania 0,1%.

Wyniki badań przesiewowych skłoniły nas do przejścia na chromatografię chiralną, mimo że może się wydawać, że tego typu technika nie jest konieczna do rozdzielania izomerów geometrycznych w przeciwieństwie do optycznych. Do dalszych badań użyto kolumn Chiralcel, z fazą ruchomą składającą się z wody, acetonitrylu i kwasu ortofosforowego lub buforu fosforanowego o dostosowanym pH 3,0. Sprawdzono również warunki chromatograficzne (Chiralcel 150 × 4,6 mm 10 µm) podane w oczekującej monografii roztworu okulistycznego latanoprostu, ale uznano je za nieodpowiednie. Różne modyfikacje składu fazy ruchomej i przepływu doprowadziły do oczekiwanego rozdzielenia obu grup sygnałów krytycznych w chiralnej stacjonarnej fazie odwróconej tris (3,5-dimetylofenylokarbamianu) celulozy powlekanej żelem krzemionkowym, ale tylko dla mono i combo produktów bez konserwantu chlorku benzalkoniowego.

W produktach zawierających BAC, sygnały pochodzące od homologów C12 i C14 zajmowały duży obszar chromatogramu i uniemożliwiały ocenę zanieczyszczenia F, zanieczyszczenia E i enancjomeru. Z tego powodu w następnym kroku sprawdzono kolumnę Chiralcel o mniejszej wielkości cząstek 3,5 µm, jednak nie uzyskano pożądanego wyniku dla produktów z konserwantem. Dla produktów bez konserwantów czułość metody nie była zadowalająca ze względu na bardzo małą powierzchnię piku zanieczyszczenia E i enancjomeru.

Główną ideą opracowywanej metody była uniwersalność, umożliwiająca śledzenie specyficznych zanieczyszczeń latanoprostu w preparatach niezależnie od zastosowanych różnych substancji pomocniczych. Dlatego też, biorąc pod uwagę dostępną literaturę na temat metod oznaczania latanoprostu w preparatach zawierających chlorek benzalkoniowy, zbadano nowe rozwiązanie. Zastosowano więc układ składający się z obu faz stacjonarnych w kolumnie chiralnej i cyjanowej oraz fazy ruchomej składającej się z wody, acetonitrylu i kwasu ortofosforowego. Głównym zadaniem kolumny cyjanowej było wydłużenie retencji homologów chlorku benzalkoniowego, podczas gdy kolumna chiralna odpowiadała za rozdzielanie izomerów latanoprostu.

Połączenie faz stacjonarnych przesunęło piki homologów BAC C12 i C14 poza region elucji pików substancji pokrewnych latanoprostu i poprawiło ich rozdzielenie, umożliwiając w ten sposób ich ilościowe oznaczenie wraz z zawartością latanoprostu w obecności konserwantu. Przeprowadzono kilka eksperymentów w celu modyfikacji gradientu fazy ruchomej, aby zoptymalizować metodę i uzyskać oczekiwane parametry chromatograficzne. Ostatecznie uzyskano odpowiednie rozdzielenie i wymagane parametry krytyczne: Rs latanoprost/latanoprost imp F = 2,0; enancjomer latanoprostu/imp E latanoprost—1,3; współczynnik symetrii piku latanoprostu przy 100% stężeniu—1,5; oraz LOQ = 0,1%.

Czy metoda spełnia wymagania walidacji, precyzji i stabilności?

Przydatność układu chromatograficznego sprawdzono poddając roztwór testu przydatności systemu (SST) (raz) i roztwór referencyjny latanoprostu 1% i 100% (pięć razy) systemom Waters i Agilent oraz porównując wyniki z ustalonymi kryteriami akceptacji. Wszystkie wyniki spełniły ustalone kryteria akceptacji.

Swoistość metody badano poprzez porównanie czasu retencji i widma UV w zakresie 190-400 nm uzyskanych dla następujących roztworów wzorcowych: zanieczyszczenia D, E, F, H, enancjomeru latanoprostu i 15-ketolatanoprostu z parametrami uzyskanymi dla próbek produktu; produktów wzbogaconych zanieczyszczeniem H latanoprostu, zanieczyszczeniem F latanoprostu, zanieczyszczeniem E latanoprostu i 15-ketolatanoprostem na poziomach ok. 2,0%, 3,5% i 0,5%; oraz enancjomeru latanoprostu na poziomie około 0,15% w stosunku do deklarowanej zawartości latanoprostu w kroplach do oczu. Zbadano również swoistość metody dla TPPO, jak opisano w innych badaniach. Równolegle analizowano roztwór wzorcowy TPPO o stężeniu 1% i produkt Xalatan wzbogacony 1% TPPO. Chromatogramy pokazują, że wszystkie piki pochodzące od znanych zanieczyszczeń są dobrze oddzielone od innych pików, a także od sygnału substancji czynnej.

Aby potwierdzić zdolność badanej metody do wskazywania stabilności i zbadać główne potencjalne produkty degradacji latanoprostu, przeprowadzono badania wymuszonej degradacji w surowych warunkach fizycznych i chemicznych. Czynniki degradujące zostały wybrane tak, aby substancja czynna uległa redukcji maksymalnie do 30%. W przypadku hydrolizy alkalicznej, użycie 0,2 M NaOH doprowadziło do całkowitej hydrolizy estru i utworzenia 100% kwasu latanoprostowego. Dlatego zastosowano łagodniejsze warunki, tj. połowę stężenia NaOH do rozkładu latanoprostu, a tylko produkt bez timololu wykazał wzrost degradantów. Bilans masowy dla wszystkich typów reakcji mieścił się w zakresie 95-105%, co wskazuje na przydatność metody do monitorowania stabilności formulacji zarówno mono, jak i combo produktów.

Badania wymuszonej degradacji wykazały, że dwa znane zanieczyszczenia procesowe latanoprostu, H i F, pochodzące z syntezy organicznej (wymienione w monografii latanoprostu Ph. Eur. 2230) mogą tworzyć się w produktach leczniczych w wyniku degradacji. Zanieczyszczenie H może powstawać w wyniku różnych typów degradacji, zarówno przez hydrolizę alkaliczną, jak i kwasową, a także w podwyższonych temperaturach. Ponieważ produkty okulistyczne są roztworami wodnymi, które sprzyjają reakcjom hydrolizy, zanieczyszczenie H należy uznać za główny i najbardziej typowy produkt degradacji. Zanieczyszczenie chemiczne H to wolny kwas latanoprostowy powstający w wyniku hydrolizy nieaktywnego proleku latanoprostu w postaci estru izopropylowego w farmakologicznie aktywną cząsteczkę. Literatura dokładnie i powszechnie odnotowuje to jako główny degradant wodnych roztworów latanoprostu. In vivo tworzy się bardzo szybko, gdy latanoprost jest hydrolizowany przez enzymy esterazy, które są obfite w rogówce.

Utlenianie grupy hydroksylowej C-15 bez hydrolizy estru izopropylowego prowadzi do powstania 15-ketolatanoprostu. Chociaż literatura wspomina o tym jako o drobnym degradancie latanoprostu w testowanych produktach mono i combo z BAC, nie pojawia się on po degradacji. Donosi się, że wodne roztwory latanoprostu są niestabilne i wysoce wrażliwe na światło i podwyższone temperatury, tworząc w ten sposób produkty degradacji, a mianowicie kwas latanoprostowy i 15-ketolatanoprost. Co godne uwagi, dla produktów mono z lub bez BAC, wpływ światła nie był znaczący; jednak dla produktów kombinowanych zaobserwowano wysoki stopień degradacji latanoprostu. Zaobserwowano znaczny wzrost zanieczyszczenia F, prawdopodobnie związany z timololem w składzie leku. Potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić i zrozumieć mechanizmy reakcji.

Nasze badania wymuszonej degradacji wykazały różnice między ścieżkami degradacji produktów mono i combo. Podczas przeglądu danych stwierdziliśmy, że produkt z timololem był bardziej podatny na światło UV. Po godzinie ekspozycji na światło UV zawartość latanoprostu w produkcie łączonym zmniejszyła się do 70%; w tym samym czasie zanieczyszczenie F wzrosło o 22%, podczas gdy produkt mono pozostał niezmieniony w porównaniu z produktem nieeksponowanym. W literaturze nie ma odniesień do degradacyjnej natury zanieczyszczenia F. Oczekująca monografia USP wskazuje na potrzebę oceny zawartości zanieczyszczenia F w produktach, ale wymóg ten może być związany z limitem monografii USP dla czystych substancji, wynoszącym 3,5%. Przekracza to poziomy identyfikacji i kwalifikacji zgodnie z wytycznymi ICH, a zatem wymaga śledzenia w produktach.

Precyzję układu pomiarowego oceniono, stosując sześć wstrzyknięć roztworów wzorcowych latanoprostu do kolumny chromatograficznej w stężeniach około 50 µg/mL (100% w stosunku do deklarowanego oznaczenia latanoprostu w produkcie leczniczym) i 0,50 µg/mL (~1,0% w stosunku do deklarowanego oznaczenia latanoprostu w produkcie leczniczym), wraz z modelową próbką produktu z timololem i BAC, wzbogaconą trzema zanieczyszczeniami latanoprostu (H, F i E) na poziomie odpowiednio ~1,0%, ~1,8% i ~0,3% (co odpowiada rzeczywistym stężeniom 0,50 µg/mL, 0,88 µg/mL i 0,14 µg/mL). Oceniono zmienność powierzchni pików i czasów retencji uzyskanych z sześciu wstrzyknięć.

Powtarzalność metody określono, analizując sześć niezależnych próbek produktów wzbogaconych zanieczyszczeniami H, F i E. W celu zbadania precyzji pośredniej metody testowej dokonano następujących zmian warunków pomiaru: inny analityk; inny dzień analizy; inny system HPLC; i różne odczynniki. Wyniki poddano analizie statystycznej; w celu określenia przedziału ufności wartości średniej oszacowano parametry statystyczne, takie jak średnia, SD i RSD% dla sześciu i dwunastu próbek.

Liniowość oznaczenia dla substancji pokrewnych latanoprostu w badanym produkcie zweryfikowano, oceniając pięć poziomów stężenia zanieczyszczenia H dla zakresu 0,10% (RT) ÷ 3,5%, zanieczyszczenia F dla zakresu 0,10% (RT) ÷ 5,5%, zanieczyszczenia E dla zakresu 0,10% (RT) ÷ 0,8% i latanoprostu dla zakresu 0,10% (RT) ÷ 5,5%. Dla każdego poziomu stężenia przygotowano 3 próbki modelowe zawierające wszystkie substancje pomocnicze produktu i znane ilości oznaczanej substancji.

Potwierdzono pozytywną korelację liniową między stężeniem analitu a mierzonym sygnałem dla latanoprostu i badanych zanieczyszczeń (E, H i F). Świadczyły o tym współczynniki korelacji bardzo bliskie 1,0 oraz wartości p obliczone dla krzywych kalibracyjnych, z których wszystkie były znacznie poniżej założonego poziomu ufności (p = 0,05) i potwierdziły, że korelacja modelu liniowego jest statystycznie istotna.

Badania powtarzalności analitycznej metody i precyzji pośredniej wykazały, że metoda spełniła założone kryteria akceptacji pod względem uzyskanych wartości RSD dla sześciu powtórzeń, a także dla badania precyzji pośredniej dwunastu powtórzeń obejmujących losowe zmiany, które mogą wpływać na określone wartości. Wartości RSD% oznaczenia latanoprostu w badaniach precyzji (powtarzalność i precyzja pośrednia) dla obu badanych produktów były poniżej przewidywanych wartości RSD wynoszących 2,0% i 4,0% odpowiednio dla powtarzalności i precyzji pośredniej.

W oparciu o wytyczne AOAC Official Methods of Analysis (2016) Guidelines for Standard Method Performance Requirements Appendix F, przyjęliśmy oczekiwane kryteria akceptacji dla badania precyzji metody dotyczącej substancji pokrewnych. Zgodnie z tymi wytycznymi, oczekiwana precyzja jest funkcją stężenia analitu. W konsekwencji, dla analitu obecnego na poziomie 0,1 µg/mL (0,1 ppm), tj. zanieczyszczeń H, E i latanoprostu (przy stężeniu do oceny nieznanego zanieczyszczenia), oczekiwane wartości RSD dla badania powtarzalności i precyzji pośredniej wynoszą odpowiednio 15% i 22%; natomiast dla zanieczyszczenia F – testowanego przy stężeniu około 1 ug/mL (1 ppm) – wynoszą odpowiednio 11% i 16%. Wszystkie wyniki były znacznie niższe niż założone wartości krytyczne, a najwyższą wartość RSD (n = 12) wynoszącą 18,1% odnotowano dla zanieczyszczenia E w badaniu precyzji pośredniej produktu mono latanoprostu. Biorąc pod uwagę zmienność przy tak niskim stężeniu zanieczyszczenia E (0,11 ug/mL), należy zauważyć, że różnica w średnich bezwzględnych zawartościach zanieczyszczenia E między testami – wykonanymi w różnych dniach przez innego analityka przy użyciu różnych partii odczynników i systemów chromatograficznych – wyniosła tylko 0,05 ppm (ug/mL). Świadczy to o dobrej precyzji testowanej metody.

Podsumowując, precyzja metody była odpowiednia do identyfikacji latanoprostu i jego substancji pokrewnych w niskodawkowych produktach leczniczych.

Zgodnie z wytycznymi ICH Q2 (R2) dotyczącymi określania granic wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ), można zastosować kilka podejść: ocenę wizualną opartą na krzywych kalibracyjnych lub ocenę parametru s/n. LOD i LOQ oszacowano przy użyciu odchylenia standardowego odpowiedzi liniowej i nachylenia zgodnie z formułami DL i QL, gdzie σ jest odchyleniem standardowym odpowiedzi, a S jest nachyleniem krzywej kalibracyjnej.

Obliczone wartości zostały następnie eksperymentalnie potwierdzone na podstawie roztworu latanoprostu o stężeniu zbliżonym do tych wartości. Następnie oszacowane wartości graniczne zostały eksperymentalnie zweryfikowane poprzez sześciokrotną analizę roztworów latanoprostu o stężeniach 0,025 µg/mL, 0,035 µg/mL i 0,050 µg/mL. Określono stosunek sygnału do szumu i odchylenie standardowe powierzchni sygnału z sześciu wstrzyknięć. Wyniki oceniono względem następujących wymagań: dla LOD stosunek sygnału do szumu nie mniejszy niż 3; dla LOQ stosunek sygnału do szumu nie mniejszy niż 10; oraz dla RSD, n = 6 nie większy niż 5,0%.

Eksperymentalnie określona granica oznaczalności była mniejsza niż przyjęta wartość progu raportowania 0,050 µg/mL (0,1% w stosunku do deklarowanej zawartości latanoprostu w badanych produktach), co wskazuje na jej odpowiednio wysoką czułość do określania czystości produktów niskodawkowych.

Odporność procedury analitycznej jest miarą jej zdolności do pozostania niezmienioną przez małe, ale celowe zmiany parametrów metody. Wskazuje to na jej niezawodność podczas normalnego użytkowania. Wpływ małych zmian w stosunku do tych określonych w metodzie zweryfikowano poprzez przeprowadzenie analizy w różnych warunkach eksperymentalnych. Uwzględniono następujące czynniki: zmiany w składzie fazy ruchomej (±2% acetonitrylu); zmiany temperatury kolumny (±2 °C); oraz zmiany w zestawie chromatograficznym (aparatura i numery seryjne kolumn; typy detektorów: UV i PDA). W celu określenia odporności metody przeprowadzono badanie stabilności próbek testowych, roztworów referencyjnych latanoprostu i roztworu SST w standardowych warunkach przechowywania roztworów w komorze autosamplera i lodówce. Porównaliśmy parametry SST z chromatogramów roztworu referencyjnego i roztworu SST uzyskanych w różnych warunkach testowych. We wszystkich analizowanych przypadkach spełnione zostały wymagane warunki SST dla metody analitycznej. Niewielka zmiana warunków analizy nie wpłynęła na wyniki oznaczenia latanoprostu, a wartości RSD% dla wszystkich typów zmian mieściły się w oczekiwanej precyzji metody, tj. RSD ≤ 2,0%. W przypadku badania substancji pokrewnych, wyniki zanieczyszczeń w różnych warunkach badania zmieniały się w granicach precyzji metody. Jednak zakres zmian acetonitrylu (+/−2%) w stosunku do tych ustalonych w procedurze nie został przekroczony ze względu na wysoką wartość RSD dla określonej zawartości zanieczyszczenia E. Podsumowując, dokładność przygotowania fazy ruchomej powinna być ściśle przestrzegana w granicach ustalonych podczas testu odporności metody.

Badania stabilności potwierdziły, że przy przechowywaniu w lodówce (temperatura 5 °C ± 3 °C), standardowy roztwór latanoprostu był stabilny przez 10 dni, a roztwór SST był stabilny przez 3 miesiące.

Jakie są zastosowania i ograniczenia opracowanej metody?

Celem tego badania było opracowanie metody jednoczesnej identyfikacji zawartości latanoprostu i jego sześciu zanieczyszczeń (w tym izomerów geometrycznych i optycznych) w kroplach do oczu zawierających latanoprost z lub bez chlorku benzalkoniowego. Metoda ta została zwalidowana na podstawie formulacji produktów Xalacom i Xalatan. Została również zweryfikowana dla produktów generycznych bez konserwantów latanoprostu i latanoprostu z timololem. Wyniki wskazują na możliwość zastosowania tej procedury do różnych niskodawkowych preparatów farmaceutycznych latanoprostu.

Aby zapewnić wysoką jakość i bezpieczeństwo produktu leczniczego, niezwykle ważne jest opracowanie metod, które mogą charakteryzować profile zanieczyszczeń specyficzne dla danej formulacji farmaceutycznej. Latanoprost jest bardzo silną substancją, która jest stosunkowo podatna na rozkład pod wpływem temperatury, światła, środków utleniających i czynników hydrolitycznych. W wyniku degradacji powstają znane zanieczyszczenia strukturalne i niezidentyfikowane produkty degradacji. Biorąc pod uwagę strukturę cząsteczki latanoprostu – charakteryzującą się obecnością pięciu chiralnych atomów węgla i kilku wiązań podwójnych – liczba potencjalnych produktów degradacji i transformacji (w tym izomerów) jest bardzo wysoka, a ich aktywność biologiczna nie jest znana. Niektóre zanieczyszczenia latanoprostu wykazują aktywność biologiczną. Zanieczyszczenie H (kwas latanoprostowy) jest metabolitem latanoprostu, o 200-krotnie wyższej aktywności w stosunku do receptora prostaglandyny F2α niż latanoprost. Podobnie 15-ketolatanoprost jest aktywnym metabolitem; w stężeniu 0,001% obniża ciśnienie w jaskrowych oczach małp, równoważne efektowi 0,005% latanoprostu. Dlatego bardzo prawdopodobne jest, że inne zidentyfikowane i niezidentyfikowane zanieczyszczenia latanoprostu również wykazują aktywność biologiczną; jednak ich siła i kierunki są nieznane. Dlatego, aby zapewnić bezpieczne i ukierunkowane efekty terapeutyczne leków zawierających latanoprost, niezbędne jest ścisłe kontrolowanie znanych i nieznanych zanieczyszczeń i utrzymywanie ich na jak najniższym możliwym poziomie.

Opracowana i zwalidowana metoda kontroluje zawartość substancji czynnej, sześć znanych zanieczyszczeń latanoprostu i czystość enancjomeryczną produktu. Wydaje się to szczególnie cenne podczas badań rozwojowych, gdy konieczne jest zebranie jak najszerszej wiedzy dotyczącej produktów degradacji, ich dróg powstawania i stabilności ich formulacji.

Zaletą tej metody jest to, że może testować produkty mono lub kombinowane. Może identyfikować różnice między testowanymi kompozycjami pod względem profilu zanieczyszczeń i stabilności formulacji. Rzeczywiście, możliwe było wykazanie, że zanieczyszczenie F jest charakterystyczne dla złożonych formulacji i może nie wynikać jedynie z syntezy API, jak opisano w literaturze. Stosowanie tej metody badawczej do analizy zawartości i substancji pokrewnych oraz oceny czystości enancjomerycznej dla dwóch produktów przekłada się na zysk ekonomiczny ze względu na zmniejszenie wykorzystywanych standardów i materiałów niezbędnych do przeprowadzenia analizy. Ponadto wykorzystanie degradacji in situ do generowania zanieczyszczenia H w przygotowaniu roztworu SST ma również aspekt ekonomiczny; pozwala to uniknąć konieczności zakupu drogich standardów (na przykład Latanoprost Impurity H Reference Standard kosztuje 1000 EUR za 0,0002 mg). Nasza metoda jest dokładna, liniowa i precyzyjna, i jest odpowiednia do zamierzonego celu. Należy podkreślić, że jest wrażliwa, co jest kluczowe dla niskodawkowych produktów farmaceutycznych, dla których próg raportowania jest ustalony na 0,1% na podstawie dawki zalecanej przez ICH. Słabością metodologii jest czas analizy wynoszący 140 min; jednak biorąc pod uwagę liczbę danych, które można uzyskać z jednej analizy, wydaje się, że korzyści przeważają nad zużyciem czasu.

Zastosowanie tej metody w innych składach substancji pomocniczych wydaje się możliwe, ale wymaga dalszych badań w celu weryfikacji wybranych charakterystyk walidacji. Opracowana metoda analityczna została przetestowana z niskodawkowymi produktami latanoprostu o znanych składach: Xalacom, Xalatan i produkty generyczne bez konserwantów. Produkty te różniły się substancjami pomocniczymi. Dlatego dla każdego składu potwierdzono swoistość metody, udowadniając, że: piki pochodzące ze składników nośnika i jego degradacji, a w przypadku złożonego produktu, piki pochodzące z drugiej substancji czynnej (tj. timololu i jego zanieczyszczeń) nie interferują i są odpowiednio oddzielone (Rs ≥ 1,0) od piku latanoprostu, sygnałów pochodzących z jego określonych zanieczyszczeń i jego nieznanych produktów degradacji. Przy stosowaniu tej metody do innych niskodawkowych produktów latanoprostu ze złożonymi substancjami pomocniczymi lub drugim API, konieczne byłoby przeprowadzenie badań swoistości, ze szczególnym naciskiem na badania degradacji prowadzone oddzielnie dla nośnika/matrycy i produktu w celu identyfikacji sygnałów pochodzących z substancji pomocniczych i ich możliwych produktów degradacji. Konieczne byłoby również ocenienie ich wpływu na możliwość prawidłowej identyfikacji latanoprostu i jego substancji pokrewnych.

Biorąc pod uwagę niski stosunek stężenia latanoprostu do stężeń stosowanych substancji pomocniczych lub drugiego API (na przykład stężenie timololu jest 100 razy wyższe niż stężenie latanoprostu, a ilość netarsudilu w złożonym produkcie z latanoprostem jest 4 razy wyższa niż w latanoproście) oraz wysoką czułość metody niezbędną do oceny substancji pokrewnych latanoprostu na poziomie raportowania powyżej 0,1% w stosunku do deklarowanej zawartości 50 ug/mL; głównym ograniczeniem metody jest to, że sygnały z substancji pomocniczych lub drugiego API (a także ich produktów degradacji) są widoczne na chromatogramach produktu i mogą utrudniać rozróżnienie pików od zanieczyszczeń latanoprostu. Ponadto niskie stężenie i słaba absorbancja latanoprostu powodują, że piki w nośniku/matrycy i jego degradacja mogą być znacznie wyższe niż piki zanieczyszczeń latanoprostu. Może to przekładać się na trudności w prawidłowej identyfikacji pików pochodzących z nieznanych zanieczyszczeń latanoprostu i nośnika w rutynowej analizie.

Przykładem wyżej wymienionego problemu w analizach Xalacom i Xalatan jest alkohol benzylowy, główny degradant BAC, który jest widoczny na chromatogramach przy sygnale RT ~18,4. Ocena piku na etapie badania degradacji opiera się na widmie UV; roztwory wzorcowe referencyjne mogą zidentyfikować ten pik i wykluczyć go z oceny. Jednak nieprawidłowe traktowanie tego sygnału jako produktu degradacji latanoprostu dostarczyłoby fałszywych wyników w ocenie jakości produktu i wyników OOS pod względem zanieczyszczeń. Podobnie, produkt degradacji timololu został również wykryty na chromatogramie produktów combo po degradacji. Dlatego dogłębna znajomość produktu podczas wymuszonej degradacji poszczególnych składników produktu i wykorzystanie dostępnych standardów referencyjnych oraz dodatkowe wsparcie widmami UV są niezbędne do prawidłowej oceny chromatogramów. Jednym z proponowanych rozwiązań jest wprowadzenie testu nośnika/matrycy jako ślepej próby w standardowej analizie wydajności, co może znacznie ułatwić ocenę chromatogramów i identyfikację pików. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę wykazaną swoistość tej metody, może być ona z powodzeniem stosowana jako metoda platformowa dla innych niskodawkowych produktów zawierających latanoprost, nawet tych ze złożonymi substancjami pomocniczymi lub drugim API, takim jak timolol lub netarsudil.

Głównym celem tej metody jest: Monitorowanie produktów degradacji latanoprostu w różnych formulacjach na etapie rozwoju, aby (1) pokazać wszystkie potencjalne zanieczyszczenia, które mogą pojawić się z powodu starzenia w całym okresie przydatności do użycia i (2) podkreślić znaczący wpływ jego składu na wszelkie powstające zanieczyszczenia. Dlatego metoda została opracowana, aby monitorować jak najwięcej zanieczyszczeń. Pierwotny cel metody wyraźnie nie wyklucza możliwości jej wykorzystania do rutynowych analiz kontrolnych, co zostało potwierdzone przez naszą walidację.

Zastosowano minimalne podejście do opracowania metody w oparciu o definicję ICHQ14. Badania odporności metody przeprowadzono podczas walidacji poprzez jednowymiarowe badanie pojedynczego parametru. Biorąc pod uwagę dostępne narzędzia optymalizacji w rozszerzonym podejściu do opracowania metody, interesujące jest zoptymalizowanie metody przy użyciu eksperymentów wielowymiarowych (DoEs) w celu ustalenia wieloczynnikowych zależności zmienionych parametrów. Zapewnia to lepsze zrozumienie relacji między zmiennymi procedury analitycznej a jej odpowiedziami. Ze względu na złożony system faz stacjonarnych i długość analizy, w potwierdzonych przypadkach po określeniu potencjalnych produktów degradacji w badaniach wymuszonej degradacji i długoterminowych badaniach stabilności, metoda ta mogłaby być indywidualnie dostosowana do monitorowania tylko wybranych zanieczyszczeń, które prawdopodobnie wystąpią w komercyjnych partiach produktu leczniczego. Takie podejście znacznie skróciłoby czas analizy, prowadząc do większej użyteczności i łatwości użycia w rutynowej kontroli jakości produktu. Biorąc pod uwagę potencjał metody, można ją również zoptymalizować do jednoczesnej identyfikacji latanoprostu, jego zanieczyszczeń i degradantów chlorku benzalkoniowego, takich jak alkohol benzylowy i kwas benzoesowy. Mają one wysokie i symetryczne sygnały, potencjalnie przydatne do oznaczania ilościowego.

Opracowano i zwalidowano nową wrażliwą, dokładną i precyzyjną metodę chromatograficzną do jednoczesnego oznaczania ilościowego latanoprostu i sześciu substancji pokrewnych latanoprostu w niskodawkowych kroplach przeciwjaskrowych do oczu zawierających latanoprost w stężeniu 50 µg/mL. Metoda ta rozdziela izomery latanoprostu, (15S)-latanoprost, enancjomer latanoprostu i 5,6-trans latanoprost od sygnałów latanoprostu. Ponadto jest specyficzna dla dobrze znanych degradantów latanoprostu – głównego kwasu latanoprostowego i drobnego 15-ketolatanoprostu – a także pochodnych syntetycznych – tlenku trifenylofosfiny (TPPO) i propan-2-yl 5-(difenylofosforyl)pentanianu (IDPP). Nadaje się do testowania prostych i łączonych produktów latanoprostu z maleinianem timololu (5 mg/mL) konserwowanych chlorkiem benzalkoniowym lub bez środków konserwujących. Metoda ta jest cennym narzędziem w strategiach kontroli niskodawkowych produktów latanoprostu, zapewniając bezpieczeństwo ich stosowania i ukierunkowane efekty terapeutyczne. Co więcej, metoda ta jest potencjalną platformą do testowania formulacji o różnej złożoności zawierających 0,005% latanoprostu.

Podsumowanie

Opracowano i zwalidowano innowacyjną metodę chromatograficzną do jednoczesnego oznaczania latanoprostu i jego sześciu substancji pokrewnych w kroplach do oczu o niskim stężeniu. Metoda skutecznie rozdziela izomery latanoprostu oraz identyfikuje jego główne produkty degradacji, w tym kwas latanoprostowy i 15-ketolatanoprost. Jest odpowiednia zarówno dla preparatów zawierających sam latanoprost, jak i w połączeniu z timololem, z konserwantem lub bez. Metoda wykazuje wysoką czułość, dokładność i precyzję, spełniając wymagania ICH dotyczące oznaczania zanieczyszczeń na poziomie 0,1%. Badania stabilności i degradacji wykazały, że metoda skutecznie monitoruje profile zanieczyszczeń specyficzne dla różnych formulacji, co jest kluczowe dla zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności terapeutycznej produktów zawierających latanoprost. Głównym ograniczeniem jest długi czas analizy, jednak korzyści z kompleksowej oceny jakości przewyższają tę niedogodność.